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Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析(二)

發(fā)布時(shí)間:2020/6/2 15:21:41      閱讀次數:1903

 

Western Blot是實(shí)驗室中常見(jiàn)且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗方法,通常我們在日常交流中說(shuō)的就是簡(jiǎn)稱(chēng)“WB”,中文名稱(chēng)是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應,通常用來(lái)判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低.


在上周文章“Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析”,我們講到了Western Blot實(shí)驗結果中常見(jiàn)的條帶弱 條帶彎曲彌散三種現象,這次我們再來(lái)講講蛋白提取時(shí)需注意的地方及結果條帶雜帶多 背景臟等常見(jiàn)問(wèn)題.

 

<  蛋 白 提 取  >

 

以裂解組織樣本提取蛋白為例,操作步驟簡(jiǎn)易如下:

組織剪成小塊 按一定比例加入裂解液 勻漿 充分裂解后離心取上清用于后續實(shí)驗


當我們用RIPA裂解液時(shí),常會(huì )發(fā)現裂解產(chǎn)物中有一小團透明的膠狀物質(zhì).不用擔心,這是正,F象,這團膠狀物是含有基因組DNA等的復合物.如果檢測的蛋白不是和基因組結合特別緊密的,可以直接離心后取上清用于后續實(shí)驗,當然也可以超聲打散再離心取上清.

在提取蛋白時(shí),我們需注意:

1. 盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理,避免蛋白丟失;

2. 根據蛋白定位選擇合適的裂解緩沖液,并加入合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準確性;

3. 低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解,所有離心機需提前預冷,所有操作在冰上完成;

4. 樣品裂解液應新鮮制備,并且分裝凍存于-80℃,切勿反復凍融已經(jīng)制備好的樣品.
 

<  常 見(jiàn) 問(wèn) 題 之 雜 帶 多  >

 

原因分析1:曝光時(shí)間太長(cháng);
解決方案1:縮短曝光時(shí)間;
原因分析2:抗體 抗原濃度高;
解決方案2:降低抗體 抗原濃度,建議用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋二抗;
原因分析3:交叉反應性,抗體質(zhì)量問(wèn)題;
解決方案3:選擇單克隆抗體,選擇高品質(zhì)的抗體.

 

<  常 見(jiàn) 問(wèn) 題 之 背 景 臟  >

 

原因分析1:緩沖液污染;
解決方案1:使用新配制的緩沖液,緩沖液最好現用現配;
原因分析2:封閉不完全,封閉液選擇有誤;
解決方案2延長(cháng)封閉時(shí)間,推薦正常血清做封閉液;
原因分析3:膜污染,漂洗不完全;
解決方案3:更換新膜,操作中戴手套,用鑷子夾膜,避免直接接觸膜;增加漂洗時(shí)間和緩沖液體積;


BSA 血清脫脂奶粉作為封閉液區別:

BSA是最常用的封閉液,成分單一適用于大多數情況,不可用于偶聯(lián)BSA的免疫原的封閉.


血清的封閉主要有兩方面,一方面是封閉待測樣本某些物質(zhì)與蛋白非特異性的結合,從而降低背景,從這點(diǎn)看,血清和BSA沒(méi)有明顯區別.另一方面是待測樣品中可能會(huì )有Fc受體,Fc受體與抗體的結合與特異性無(wú)關(guān),而封閉血清中有抗體可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結合,BSA無(wú)法封閉Fc受體.


脫脂奶粉的成分相對復雜,較BSA和血清應用要少一些.脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時(shí),會(huì )造成高背景或本底水平增高.


<  常 見(jiàn) 問(wèn) 題 之 分 子 量 錯 誤  >

原因分析1:分子量偏大,可能蛋白發(fā)生糖基化 甲基化修飾,融合了標簽蛋白;
解決方案1:查找文獻看下是否蛋白發(fā)生修飾,將融合的標簽蛋白分子量與目的蛋白分子量相加,為正確的分子量.

原因分析2:分子量偏小,可能存在不同的剪接體或者目的蛋白被降解;
解決方案2:查閱文獻或者通過(guò)搜索數據庫來(lái)確定該蛋白是否存在多種不同的編碼mRNA,確保蛋白樣本未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑.
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