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      Western Blot 常見問題分析(二)

      發布時間:2020/6/2 15:21:41      閱讀次數:1670

       

      Western Blot是實驗室中常見且重要的一種分子生物學實驗方法,通常我們在日常交流中說的就是簡稱“WB”,中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質是抗原抗體的特異性反應,通常用來判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低.


      在上周文章“Western Blot 常見問題分析”,我們講到了Western Blot實驗結果中常見的條帶弱 條帶彎曲彌散三種現象,這次我們再來講講蛋白提取時需注意的地方及結果條帶雜帶多 背景臟等常見問題.

       

      <  蛋 白 提 取  >

       

      以裂解組織樣本提取蛋白為例,操作步驟簡易如下:

      組織剪成小塊 按一定比例加入裂解液 勻漿 充分裂解后離心取上清用于后續實驗


      當我們用RIPA裂解液時,常會發現裂解產物中有一小團透明的膠狀物質.不用擔心,這是正,F象,這團膠狀物是含有基因組DNA等的復合物.如果檢測的蛋白不是和基因組結合特別緊密的,可以直接離心后取上清用于后續實驗,當然也可以超聲打散再離心取上清.

      在提取蛋白時,我們需注意:

      1. 盡可能采用簡單方法進行樣品處理,避免蛋白丟失;

      2. 根據蛋白定位選擇合適的裂解緩沖液,并加入合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準確性;

      3. 低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解,所有離心機需提前預冷,所有操作在冰上完成;

      4. 樣品裂解液應新鮮制備,并且分裝凍存于-80℃,切勿反復凍融已經制備好的樣品.
       

      <  常 見 問 題 之 雜 帶 多  >

       

      原因分析1:曝光時間太長;
      解決方案1:縮短曝光時間;
      原因分析2:抗體 抗原濃度高;
      解決方案2:降低抗體 抗原濃度,建議用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋二抗;
      原因分析3:交叉反應性,抗體質量問題;
      解決方案3:選擇單克隆抗體,選擇高品質的抗體.

       

      <  常 見 問 題 之 背 景 臟  >

       

      原因分析1:緩沖液污染;
      解決方案1:使用新配制的緩沖液,緩沖液最好現用現配;
      原因分析2:封閉不完全,封閉液選擇有誤;
      解決方案2延長封閉時間,推薦正常血清做封閉液;
      原因分析3:膜污染,漂洗不完全;
      解決方案3:更換新膜,操作中戴手套,用鑷子夾膜,避免直接接觸膜;增加漂洗時間和緩沖液體積;


      BSA 血清脫脂奶粉作為封閉液區別:

      BSA是最常用的封閉液,成分單一適用于大多數情況,不可用于偶聯BSA的免疫原的封閉.


      血清的封閉主要有兩方面,一方面是封閉待測樣本某些物質與蛋白非特異性的結合,從而降低背景,從這點看,血清和BSA沒有明顯區別.另一方面是待測樣品中可能會有Fc受體,Fc受體與抗體的結合與特異性無關,而封閉血清中有抗體可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結合,BSA無法封閉Fc受體.


      脫脂奶粉的成分相對復雜,較BSA和血清應用要少一些.脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時,會造成高背景或本底水平增高.


      <  常 見 問 題 之 分 子 量 錯 誤  >

      原因分析1:分子量偏大,可能蛋白發生糖基化 甲基化修飾,融合了標簽蛋白;
      解決方案1:查找文獻看下是否蛋白發生修飾,將融合的標簽蛋白分子量與目的蛋白分子量相加,為正確的分子量.

      原因分析2:分子量偏小,可能存在不同的剪接體或者目的蛋白被降解;
      解決方案2:查閱文獻或者通過搜索數據庫來確定該蛋白是否存在多種不同的編碼mRNA,確保蛋白樣本未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑.
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